Refraktometri

Refraktometri 

Refraktometri adalah suatu metoda analisa yang berdasarkan atas pengukuran besaran fisika (refraksi). Dalam analisa instrumen, besaran fisika dapat dibedakan atas dua kelompok, yaitu besaran fisika selektif dan besaran fisika non selektif. Besaran fisika selektif adalah besaran fisika yang dimiliki oleh suatu komponen dalam zat dan apabila bercampur dengan besaran fisika lainnya maka nilainya tidak berpengaruh. contoh : frekuensi dan kecepatan radiasi. Besaran non-selektif adalah besaran fisika yang nilainya berubah bila ada senyawa atau besaran fisika lainnya dalam campuran. contoh : indeks bias dan warna.

Banyak peristiwa alam atau fenomena alam yang disebabkan oleh keberadaan cahaya. Spektrum gelombang elektromagnetik yang dimiliki cahaya mempunyai panjang gelombang antara 380 – 780 nm. Sedangkan sifat-sifat gelombang elektromagnetik cahaya yaitu dapat dipantulkan (refleksi), dibiaskan (refraksi), dilenturkan (defraksi), dan digabungkan (interferensi).

Jika cahaya melintas dari suatu medium ke medium yang lainnya, maka sebagian cahaya dipantulkan dan sebagian lainnya dibiaskan, pembiasan tersebut tergantung dari indeks bias pada medium yang dilewati cahaya. Pembiasan cahaya pada medium yang dilewati cahaya merupakan peristiwa pembelokan sinar masuk dari suatu medium ke medium lain yang berbeda kerapatannya sehingga arah sinar diubah arahnya. Berikut ini Gambar 1 Pemantulan dan pembiasan cahaya, seberkas sinar datang melewati udara kemudian melewati air, maka aka ada sinar pantul dan sinar bias.

Pemantulan dan pembiasan cahaya

Arah pembiasan cahaya dibedakan menjadi dua macam yaitu mendekati garis normal atau mendekati garis normal, seperti terlihat pada Gambar di bawah. Arah pembiasan cahaya berikut ini.

a                                                                      b

Pada Gambar a adalah cahaya dibelokkan menjauhi garis normal dan Gambar b adalah cahaya di belokan mendekati garis normal. Cahaya dibiaskan menjauhi garis normal jika cahaya merambat dari medium rapat ke kurang rapat, contohnya cahaya merambat dari udara kedalam air. Sedangkan cahaya dibiaskan mendekati garis normal jika cahaya merambat dari medium kurang rapat ke medium rapat, contohnya cahaya merambat dari dalam air ke udara.

Hukum tentang pembiasan cahaya dikenal dengan hukum Snellius, yaitu: 

•        Perbandingan antara sinus sudut datang dengan sinus sudut bias selalu tetap.

•        Jika sinar datang dari medium rapat ke medium yang kurang rapat, sinar akan dibiaskan menjauhi garis normal.

•        Jika sinar datang dari medium yang kurang rapat ke medium yang rapat, maka sinar akan dibiaskan mendekati garis normal.

•        Jika sinar datang tegak lurus bidang maka sinar tidak dibiaskan melainkan diteruskan.

Indeks bias adalah perbandingan kecepatan rambat cahaya dalam ruang hampa dengan kecepatan cahaya pada suatu medium.  Indeks bias ini merupakan salah satu dari beberapa sifat optis yang penting dari medium. Indeks bias memainkan peran yang cukup penting di dalam beberapa bidang diantaranya adalah dalam bidang kimia, pengukuran terhadap indeks bias secara luas telah digunakan antara lain untuk mengetahui konsentrasi larutan dan mengetahui komposisi bahan-bahan penyusun larutan. Indeks bias juga dapat digunakan untuk mengetahui kualitas suatu larutan. 

Dalam bidang industri makanan dan minuman, indeks bias dapat digunakan untuk mengetahui besarnya konsentrasi gula dalam produk makanan dan minuman, seperti contoh untuk mengetahui kandungan gula dalam jus buah, kandungan gula dalam kue, dan lain-lain. Indeks bias suatu larutan dapat diukur dengan menggunakan beberapa metode antara lain dengan metode

interferometri yang meliputi interferometri Mach-Zender, interferometri FabryPerot dan interferometri Michelson (Pedrotti dan Pedrotti, 1993). Metode-metode ini merupakan metode yang sangat akurat untuk mengukur indeks bias. Akan tetapi metode-metode tersebut mempunyai beberapa kelemahan, antara lain pengoperasian alat yang cenderung rumit dan membutuhkan waktu yang lama. 

Metode lain yang sering digunakan untuk mengukur indeks bias adalah dengan menggunakan spektrometer. Spektrometer terdiri atas beberapa bagian, yaitu sumber cahaya monokromatik, prisma atau kristal dan teropong. Penentuan indeks bias dengan metode ini adalah dengan mengamati sudut deviasi minimum dari cahaya monokromatik yang berasal dari sumber yang keluar dari prisma atau kristal yang ditangkap oleh teropong. Metode ini juga cukup akurat untuk mengukur indeks bias. Namun demikian, metode ini juga mempunyai kelemahan yaitu selain pengoperasian alat yang rumit, metode ini membutuhkan sampel penelitian dalam jumlah yang banyak dan juga membutuhkan waktu yang lama. 

Metode lain yang juga sering digunakan untuk mengukur indeks bias adalah dengan menggunakan refraktometer. Metode ini merupkan metode yang sederhana. Sampel yang digunakan juga relatif lebih sedikit dibandingkan dengan metode-metode yang lainnya. 

Mengenal Refraktometer

Refraktometer adalah alat yang digunakan untuk menentukan konsentrasi atau kadar dari bahan terlarut dengan memanfaatkan indeks bias suatu cahaya seperti gula dan garam. Indeks bias adalah kecepatan cahaya di ruang hampa dengan kecepatan cahaya pada zat tersebut atau perbandingan dengan sinus sudut datang dengan sinus sudut bias. Nilai pada indeks bias suatu zat terlarut selalu berubah tergantung nilai suhu dan panjang gelombang yang dibiaskan. 

Prinsip kerja alat refraktometer menggunakan prisip pembiasan. Jika sampel merupakan larutan dengan konsentrasi rendah maka yang terjadi sudut refraksi akan lebar dikarenakan perbedaan refraksi dari prisma dan sampel besar. Maka skala yang terbaca akan jatuh pada skala rendah. Sedangkan, jika sampel dengan konsentrasi tinggi maka sudut refraksi akan kecil karena perbedaan refraksi prisma dan sampel kecil. 

Proses Terjadinya Pembiasan Cahaya Pada Prisma 

Prisma adalah zat bening yang dibatasi oleh dua bidang datar. Apabila seberkas sinar datang pada salah satu bidang prisma yang kemudian disebut sebagai bidang pembias I, akan dibiaskan mendekati garis normal. Sampai pada bidang pembias II, berkas sinar tersebut akan dibiaskan menjauhi garis normal. 

Pada bidang pembias I, sinar dibiaskan mendekati garis normal, sebab sinar datang dari zat optik kurang rapat ke zat optik lebih rapat yaitu dari udara ke kaca. Sebaliknya pada bidang pembias II, sinar dibiaskan menjahui garis normal, sebab sinar datang dari zat optik rapat ke zat optik kurang rapat yaitu dari kaca ke udara. Sehingga seberkas sinar yang melewati sebuah prisma akan mengalami pembelokan arah dari arah semula. Gambar 3 menunjukkan pembiasan cahaya pada prisma. 

Pembiasan cahaya pada prisma

Refraktometer memiliki beberapa bagian penting diantaranya prisma, lensa, bimetal strips, dan pemutar skala.

Bagian- bagian dari refraktometer: 

Day light plate (kaca)

Day light plate berfungsi untuk melindungi prisma dari goresan akibat debu, benda asing, atau untuk mencegah agar sampel yang diteteskan pada prisma tidak menetes atau jatuh.

Prisma (biru)

Prisma merupakan bagian yang paling sensitif terhadap goresan. Prisma berfungsi untuk pembacaan skala dari zat terlarut dan mengubah cahaya polikromatis (cahaya lampu/matahari) menjadi monokromatis.

Knop pengatur skala

Knop pengatur skala berfungsi untuk mengkalibrasi skala menggunakan aquades. Cara kerjanya ialah knop diputar searah atau berlawanan arah jarum jam hingga didapatkan skala paling kecil (0.00 untuk refraktometer salinitas, 1.000 untuk refraktometer urine).

Lensa

Lensa berfungsi untuk memfokuskan cahaya yang monokromatis.

Handle

Handle berfungsi untuk memegang alat refraktometer dan menjaga suhu agar stabil. 

Bimatal strip

Bimetal strip terletak pada bagian dalam alat (tidak terlihat) dan berfungsi untuk mengatur suhu sekitar 18 – 28 ^OC. Jika saat pengukuran suhunya mencapai kurang dari 18 ^OC atau melebihi 28 ^OC maka secara otomatis refraktometer akan mengatur suhunya agar sesuai dengan range yaitu 18 – 28 ^OC.

Lensa pembesar

Sesuai dengan namanya, lensa pembesar berfungsi untuk memperbesar skala yang terlihat pada eye piece.

Eye piece

Eye piece merupakan tempat untuk melihat skala yang ditunjukkan oleh refraktometer.

Skala

Skala berguna untuk melihat , konsentrasi, dan massa jenis suatu larutan.

Jenis Refraktometer

Ada tiga jenis refraktometer yang dikenal, yaitu: Hand Refraktometer, Refraktometer Imersi, Refraktometer ABBE.

a) Hand Refraktometer 

Macam-macam hand refraktometer:

•     Hand Refraktometer brik untuk gula 0 – 32 %

•     Hand Refraktometer salt untuk NaCl 0 – 28 %

Hand Refratometer brik 0 – 32%

Pada hand refraktometer, indeks biasnya sudah dikonversikan sehingga dapat langsung dibaca kadarnya. Alat ini biasanya hanya untuk mengukur kadar zat tertentu saja. Perbedaan dengan refraktometer lain adalah hand refraktometer mempunyai 1 lubang pengamatan.

(1)    Cara penggunaan hand refraktometer adalah sebagai berikut:

•        Refraktometer dibersihkan terlebih dahulu dengan tisu ke arah bawah

•        Refraktometer ditetesi dengan aquadest atau larutan NaCl 5% pada bagian prisma dan day light plate

•        Refraktometer dibersihkan dengan kertas tissue sisa aquadest / NaCl yang tertinggal

•        Sampel cairan diteteskan pada prisma 1 – 3 tetes

•        Skala kemudian dilihat ditempat yang bercahaya dan dibaca skalanya

•        Kaca dan prisma dibilas dengan aquades / NaCl 5% serta dikeringkan dengan tisu, dan

•        Refraktometer disimpan di tempat kering

(2)    Pemeliharaan hand refraktometer :

•        Setelah dipakai prisma dibersihkan sampai kering

•        Kalibrasi dengan aquades sampai batas biru putih yang menunjukan skala 0.

(3)    Cara Pembersihan

•        Day light plate pada refraktometer dibuka

•        Bersihkan sampel pada bidang prisma dengan menggunakan tissu kering dengan cara diusapkan ke sampel secara perlahan-lahan & hati-hati

•        Refraktometr setelah dibersihkan dengan tissue lalu dibersihkan menggunakan kertas lensa

•        Penutup prisma ditutup secara perlahan-lahan dan disimpan.

(4)    Prosedur kalibrasi hand refraktometer

•        Letakkan satu atau dua tetes aquadest diatas kaca prisma

•        Tutup penutup kaca prisma dengan perlahan

•        Pastikan aquadest memenuhi permukaan kaca prisma

•        Pembacaan : skala, melalui lubang teropong,pastikan garis batas biru tepa pada skala 0⁰Brix(% mark sukrosa)

•        Jika garis batas biru tidak tepat pada skala  0⁰Brix,  putar skrup pengatur skala hingga garis batas biru tetpat pada skala  0⁰Brix

b) Refraktometer Imersi (Refraktometer Celup)

Jenis refraktometer ini paling sederhana digunakan, tetapi memerlukan 1015 ml sampel. Refraktometer ini menggunakan cahaya buatan dan cahaya putih, dan terdiri dari kompensator Amici. Prisma tunggal dibingkai kuat di dalam teleskop yang berisi kompensator dan bukaan mata (eyepiece) seperti yang ditunjukkan di Gambar 5 Refraktometer Imersi. Skala ditempatkan di bawah bukaan mata di dalam tabung. Permukaan lebih bawah prisma itu dicelupkan ke dalam gelas Beaker kecil yang berisi sampel dengan kaca di bawah untuk merefleksikan cahaya melewati cairan. Instrumen lengkap pada posisinya, dengan penangas air untuk menjaga temperatur refraktometer tetap konstan. 

Refraktometer Imersi

Skala yang ditempatkan pada bidang yang dilihat mata dibuat berskala dari -5 sampai +105. Medan akan sebagian gelap dan sebagian terang, terpisah oleh garis tajam. Posisi garis dibaca pada skala, dan kesepuluh divisi ditemukan dengan memutar skrup mikrometer di atas instrumen, yang menggeser skala ke arah garis batas sampai menutupi divisi skala numerik lebih rendah yang dicatat sebagai hasil pengamatan. Gambar pada drum mikrometer lalu menunjukkan desimal yang harus ditambahkan. Perubahan divisi 0,01 berkaitan dengan n_D ± 0,000037. Oleh karena itu, refraktometer imersi memberi ketelitian lebih besar pada pembacaannya daripada refraktometer jenis lain, kecuali refraktometer interferensi. 

Saat indeks refraksi berubah dengan perubahan temperatur, maka kondisi temperatur standar harus dipilih. Sayangnya 17,5^oC agak sulit dibuat. Larutan yang akan diuji ditempatkan di dalam gelas Beaker sangat kecil yang didesain khusus dan ditempatkan di rak di dalam penangas air yang diiluminasi bawahnya. Arus air pada temperatur tertentu dilewatkan melintasi penangas. Hal ini dapat dilakukan dengan mengalirkan air keran dari tanki berlevel konstan ke penangas dengan laju sesuai. Dapat juga menggunakan penangas dengan temperatur konstan. 

Refraktometer yang sudah dikoreksi, sebaiknya menunjukkan pembacaan temperatur air sebagai berikut: 

15,5	18o	14,9	22o	14,0
15,3	19o	14,7	23o	13,75
15,1	20o	14,5	24o	13,5
15,0	21o	14,25	25o	13,25

Temperatur sebaiknya tidak berbeda lebih dari 0,1^oC, karena pembacaan dilaporkan hingga ke skala 0,01. Nilai pembacaan yang ingin dikonversi ke konsentrasi, maka harus menggunakan tabel yang paling terkenal, yaitu tabel Wagner. Tabel ini dapat diperoleh dari supplier instrumen itu. Tabel ini hanya menggunakan temperatur 17,5^o dan tidak ada rumus untuk mengkonversinya ke temperatur yang lain, tetapi ada juga tabel metil dan etil alkohol untuk temperatur lain. Pembacaan itu dapat dikonversi ke indeks refraksi dengan menggunakan tabel referensi yang berasal dari instrumen. 

Rentang instrumen dengan prisma 1 adalah 1,325 – 1,367. Rentang ini meliputi seluruh larutan garam dan alkohol. Untuk nilai yang lebih tinggi, perlu prisma tambahan yang memperbesar rentang hingga 1,492. Rentang refraktometer imersi lebih sempit daripada refraktometer Abbe, tetapi refraktometer imersi lebih sensitif daripada refraktometer Abbe. 

Kerugian pengujian dengan refraktometer imersi adalah perlu berhati-hati mengatur temperatur. Refraktometer imersi mengukur konsentrasi lebih teliti dan lebih cepat daripada dengan menggunakan pengukuran densitas biasa yaitu dengan hidrometer. Misalnya, di asumsikan pengendalian temperatur sudah cukup teliti hingga skala 0,02 dengan bobot zat berikut ini per 100 ml: 24 mg metil alkohol; 12 mg etil alkohol; 4 mg amonium klorida; 10 mg asam perklorat. 

Kita dapat menentukan setiap komponen campuran dengan refraktometer. Misal campuran metil dan etil alkohol. Derajat ketelitian pengukuran akan lebih baik apabila tidak ada komponen lain. Baik densitas dan indeks refraksi hanya mengukur jumlah total zat-zat di dalam larutan. Tidak penting berapa banyak perbedaan yang mungkin ada di dalam zat-zat itu. 

c) Refraktometer ABBE 

Refraktometer Abbe memiliki rentang indeks refraksi dari: n = 1,30 – 1,71 dan 1,45 –1,84, kecuali pada beberapa model terbaru. Reprodusibilitas pembacaan indeks refraksinya adalah ± 0,0002.  Instrumen ini membaca indeks refraksi secara langsung, butuh waktu lama hingga mendapatkan hasilnya, hanya memerlukan setetes sampel, dan hasil pengukuran dispersi parsialnya baik. 

Refraktometer Abbe tidak cocok untuk mengukur indeks refraksi dari larutan yang memiliki komponen volatil atau berbentuk padatan, karena ketelitiannya akan berkurang. Sampel padat dapat disisipkan ke permukaan prisma Abbe yang bawah. Spesimen yang permukaan bidangnya bening dibuat sedemikian rupa agar kontak optik dengan muka prisma, yaitu dengan cara meletakkan tetes cairan ke permukaan prisma atau dengan cara menekan dengan hati-hati padatan ke tempatnya. Sebagai cairan kontaknya digunakan cairan 1-bromonaftalena (n_D . 1,68) 

Cahaya putih (white light) digunakan untuk menghindari warna akibat batas tak jelas antara cahaya dan bidang gelap. Peristiwa ini disebabkan oleh perbedaan indeks refraksi cahaya dengan panjang gelombang berbeda-beda yang berasal dari cahaya putih. Dua prisma visi-langsung, disebut prisma Amici ditempatkan di atas lainnya di muka lensa objektif teleskop. Prisma Amici dibuat dari kaca dan didesain agar tidak mendeviasi cahaya garis natrium D. Cahaya dengan panjang gelombang lain akan terdeviasi. Dengan cara merotasi prisma Amici ini maka dapat meniadakan dispersi cahaya pada antarmuka cairan. 

Ernst Abbe (1840-1905) seorang ahli fisika dan bapak dari teknologi optik modern pada tahun 1869 merancang refraktometer yang kemudian diberi nama Refraktometer ABBE. Ernst Abbe adalah pendiri Perusahaan Carl Zeiss Jena Optical dan Schott Glasswerk. Refraktometer Abbe merupakan refraktometer standar. Larutan yang dibutuhkan sangat sedikit dan pengerjaannya lebih efisien, sehingga sering digunakan di laboratorium.

Refraktometer Abbe

Instrumen dan bagian-bagian pentingnya ditunjukkan pada Gambar 7. Bagian-bagian Refraktometer Abbe. Cahaya yang direfleksikan dari kaca akan melewati ke prisma iluminasi P₁. Kaca yang permukaan atasnya diasah kasar. Permukaan kasar berlaku sebagai sumber dari sejumlah cahaya tak terhingga, dimana cahaya itu akan melewati lapisan cairan 0,1 mm dari seluruh arah. Cahaya ini lalu masuk ke permukaan prisma P₂ yang digosok, selanjutnya cahaya direfraksi. Sinar kritis membentuk batas antara medan bagian terang dan gelap ketika dilihat dengan teleskop yang bergerak bersamaan dengan skala. Skala berada di teleskop pembaca. Temperatur harus dikendalikan di antara ± 0,2^oC. Instrumen diisi dengan casing prisma dimana air dapat lewat di sana. Termometer pendek disisipkan ke jaket air. Pengendali temperatur paling baik adalah pompa sirkulasi kecil yang berfungsi untuk melewatkan air dari thermostat ke casing prisma. Reprodusibilitas tercapai apabila menggunakan refraktometer Abbe yang lebih teliti. Ada tiga rentang ditawarkan secara komersil, yaitu 1,30 – 1,50; 1,40 – 1,70; dan 1,33 – 1,64. Pembacaan indeks refraksi dapat direproduksi di antara ± 2 x 10-5 sampai ± 6 x 10-5 apabila temperatur dijaga di antara ± 0,02^oC. 

 

              Bagian-bagian Refraktometer Abbe

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) / High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) / High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.

Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisis dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisis lebih lanjut. Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS).

Pengertian HPLC

Kromatografi cair berperforma tinggi ((Inggris): high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padattertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fase cair dan zat padatnya merupakan fase diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karana setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fase diam tertentu dan fase gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

Prinsip Kerja HPLC

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.

Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.

HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis di dalam sampel.  Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.

Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

PREPARASI SAMPEL

•    Sampel harus dalam bentuk larutan.

•    Untuk skala analisis sampel dalam μL, konsentrasi sampel yang diinjeksikan tidak boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom. Konsentrasi maksimal adalah sekitar 40 ppm.

PREPARASI FASA GERAK

•    Fasa gerak (eluen) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade HPLC. Untuk air, digunakan akuabidest.

•    Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan millipore kemudian diawagaskan (didigest) dengan sonikator sekitar 30 menit untuk menghilangkan udara terlarut.

•    Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan, untuk menghindari adanya gelembung pada selang penghubung.

•    Tabung eluen yang sudah diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang digunakan.

PENYALAAN ALAT

•    Sebelum alat dinyalakan, pastikan dalam slang penghubung antara tabung eluen dengan pompa tidak terdapat gelembung udara. Jika terdapat gelembung, buka penutup pompa kemudian buka katup slang di ujung pompa dan sedot secepatnya gelembung tersebut dari slang dengan alat penyedot gelembung yang tersedia kemudian tutup katup dan tutup pompa kembali seperti semula.

•    Hubungkan kabel alat ke sumber listrik (saklar).

•    Nyalakan tombol paling bawah alat HPLC (tombol detektor).

•    Nyalakan tombol tengah HPLC (kolom)

•    Nyalakan tombol paling atas dari HPLC (pompa)

•    Nyalakan tombol power CPU kemudian tombol power pada monitor.

MEMBUKA WINDOWS NT DAN AGILENT CHEMSTATION

•    Setelah alat dan komputer menyala, pada layar komputer akan muncul tampilan :

Windows NT workstation version 4.00

Windows NT workstation version 4.00(VGA mode)

PENYETABILAN ALAT SEBELUM INJEKSI

Sebelum injeksi, alat yang baru saja dinyalakan harus distabilkan terlebih dahulu untuk menjaga alat tersebut agar tetap awet, selain itu penyetabilan juga dimaksudkan agar alat benar-benar siap injeksi sehingga kromatogram yang dihasilkan akan bagus.

Untuk menstabilkan alat, setelah masuk ke menu Online Agilent Chemstation, klik menu Run Control. Kemudian :

• Klik pada gambar pompa, klik control, klik on.

• Klik menu Instrument, klik pada set up pump

>set gradient fasa gerak

>set laju alir

>set waktu run dan post run

catatan : dalam masa penyetabilan, setting laju alir cukup sekitar 0,1 uL/menit untuk menghemat eluen.

• Klik pada kolom, klik control, klik on.

• Klik gambar DAD signals,klik control, klik on (pada UV atau Visible), tergantung sample yang akan diinjeksikan.

• Klik menu Instrument, klik set up colomn untuk mengatur kondisi kolom yang diinginkan.

• Klik menu Instrument, klik Set Up DAD Signals untuk mengatur panjang gelombang detektor yang diinginkan. Masukkan panjang gelombang pilihan disertai dengan tanda X.

• Biarkan alat running dalam laju alir sekitar 0,1 uL/menit selama kurang lebih 45-60 menit untuk menstabilkan.

• Setelah waktu tersebut, naikkan perlahan laju alir sampai laju alir yang diinginkan (jangan langsung pada laju alir yang diinginkan) INGAT ! Naikkan Perlahan....Agar tekanan pompa stabil...!

PERSIAPAN INJEKSI

INGAT.....: TANDA MERAH = ALAT TIDAK SIAP

TANDA BIRU = ALAT SEDANG RUNNING

TANDA HIJAU = ALAT SIAP DIINJEKSI

• Nyalakan detektor DAD dan kolom (seperti tadi)

• Perbesar tampilan kromatogram di layar agar terlihat jelas

•    Perhatikan kromatogram sampai terbentuk baseline. Untuk mendekatkan line dengan jangkauan mata, tekan ADJUST, untuk membuat baseline pada skala nol tekan BALANCE.

•    Setelah baseline yang diinginkan terbentuk, klik menu RUNCONTROL, klik SAMPLE INFO untuk memasukkan data file-folder berikut keterangan sampel.

•    Lihat tanda warna, jika sudah hijau (READY) berarti siap injeksi.

•    Sebaiknya kolom dicuci dulu dengan cara menginjeksikan fasa gerak utama ke kolom. Begitu pula setiap setelah injek satu sampel dan akan ganti dengan sampel lain, kolom harus dicuci dahulu (sekitar 20 menit), pencucian masukkan ke dalam file CUCI. 

CARA INJEKSI

•    Ambil alat injek (syringe).

•    Bilas syringe dengan zat yang sama dengan fasa gerak utama (misalnya metanol)

•    Kemudian bilas syringe dengan sampel

•    Isi syringe dengan sampel, INGAT dalam syringe yang sudah diisi tersebut tidak boleh ada ruang kosong oleh udara yang terperangkap atau gelembung udara

•    Volume injeksi maksimum adalah 20 uL karena pada injektor standar terpasang loop 20 uL

•    Masukkan jarum syringe ke injektor, buka injektor (load, putar ke atas), injek cepat, tutup injektor (inject, putar ke bawah), baru tarik jarum syringe dari injektor. Di layar segera akan ada tanda biru...Run in progress data aquasition.........

•    Setelah waktu running yang diinginkan habis, tekan tombol F8 untuk menghentikan runing. Maka komputer akan segera menghitung tinggi puncak-puncak yang keluar berikut luas puncaknya. Pada proses ini di layar akan muncul tampilan biru dengan tulisan...”Run in Progress Data Analysis”.

•    Setelah di layar muncul kembali tampilan “Ready” (hijau), maka pekerjaan selanjutnya dapat dilakukan. Untuk menginjeksikan kembali sampel lain sebaiknya kolom dicuci terlebih dahulu. Masukkan running cuci kolom ke dalam file cuci.

PRINT OUT KROMATOGRAM

•    Untuk melihat hasil analisis yang telah dilakukan komputer terhadap sampel yang telah kita injeksikan, klik menu VIEW, Klik DATA ANALYSIS.

• Kemudian Klik menu FILE dan klik LOAD SIGNALS untuk memilih file mana yang akan dibuka beserta panjang gelombang deteksi yang diinginkan. Segera akan keluar tampilan kromatogram yang dipanggil.

• Untuk menampilkan waktu retensi setiap puncak pada kromatogram yang dipanggil tersebut, Klik menu INTEGRATION lalu klik INTEGRATE. Maka segera akan muncul nilai retensi dari setiap puncak. Karena detektor yang ada yaitu DAD (Diode Arays Detector) sangat sensitif, maka setiap puncak yang muncul, sekecil apapun akan dapat terintegrasi sehingga puncak-puncak ini harus dihapus retensinya, artinya yang kita tampilkan waktu retensinya hanya puncak-puncak yang besar dan yang kita perlukan saja. Untuk keperluan tersebut, klik menu FILE, klik DELETE PEAK sampai muncul tanda X merah. Atau dapat langsung klik di menu X merah yang biasanya ada di layar. Untuk menghapusnya, klik dengan X merah tersebut di tempat-tempat yang waktu retensinya tidak ingin ditampilkan.

• Untuk mendapatkan print out kromatogram, Klik menu REPORT, klik SPECIFY REPORT untuk mengatur tampilan kromatogram yang diinginkan. Setelah siap, klik PRINT REPORT lalu tunggu sebentar sampai komputer menampilkan print previewnya. Kemudian klik pada icons PRINT yang ada di bawah print preview kromatogram.

• Untuk kembali ke RUN CONTROL (misal akan injek baru), klik menu VIEW, klik METHOD AND RUN CONTROL.

Pilih menu yang pertama (Windows NT workstation version 4.00) secepatnya, kemudian tekan ENTER.

• Kemudian akan muncul menu Begin Log On, tekan Ctrl-Alt-Del.

• Setelah itu akan muncul menu PassWord, pada password ini tidak perlu diisi apa-apa, langsung klik OK. Perhatian...DILARANG MEMASANG PASSWORD PADA PENGOLAH DATA !

• Kemudian akan muncul menu Server NT...., klik No

• Selanjutnya akan sampai di menu utama MS-Windows NT, double klik pada menu Instrument 1 Online.

Catatan : Menu Instrument 1 Offline digunakan untuk keperluan pengolahan data tanpa penyalaan alat (yang dinyalakan hanya perangkat komputernya saja). Menu ini misalnya digunakan untuk print out kromatogram yang belum sempat dilakukan atau untuk melakukan print ulang kromatogram yang sudah ada.

•    Kemudian tunggu sampai masuk ke menu Online Agilent Chemstation.

Komponen-Komponen KCKT

Komponen-komponen penting dari KCKT dapat dilihat pada Diagram Blok KCKT berikut ini :

Pompa (Pump)

Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

Injektor (injector)

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :

a. Stopped Flow

b. Solvent Flowing

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a.   Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

b.   Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

c.    Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuK ke dalam kolom. 

Kolom (Column)

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

a.   Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

b.   Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution Chromatography, EC) 

Detektor (Detector)

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.

Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain:

Detektor Fluorometer -Detektor Spektrofotometer Massa

Detektor lonisasi nyala -Detektor Refraksi lndeks

Detektor Elektrokimia -Detektor Reaksi Kimia

Elusi Gradien

Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder.

Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :

a. Total waktu analisis dapat direduksi

b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah

c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)

d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipilih dengan cara trial and error. Tabel 3. 1. berikut ini menunjukkan kompatibilitas dari bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis gradien. Dalam praktek, gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa.

© 2004 Digitized by USU digital library 6

Tabel 3. 1 : Mode Kompatibilitas dengan Gradien Mode	Solven Gradien
Kromatografi Cair padat (LSC)	Ya
Kromatografi ekslusi	Tidak
Kromatografi Penukar Ion (IEC)	Ya
Kromatografi Cair Cair (LLC)	Tidak
Kromatografi Fasa Terikat (BPC)	Ya

Pengolahan Data (Data Handling)

Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram pada rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat pada Gambar berikut ini

Dari Gambar waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung. Lni bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.

Fasa gerak

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :

1. Murni, tidak terdapat kontaminan

2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)

3. Sesuai dengan defektor

4. Melarutkan sampel

5. Memiliki visikositas rendah

6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)

Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.

Pola Elusi (Mekanisme Pemisahan) Pada Hplc

Pada HPLC pemisahan terjadi di dalam kolom, sehingga mekanisme pemisahan atau pola elusinya seperti pada kromatografi kolom. Gambar di bawah menunjukkan profil konsentrasi komponen A dan B pada awal dan akhir elusi. Koefisien partisi A > B, oleh karena itu pada proses migrasi komponen A berada di belakang komponen B. Bersamaan dengan proses migrasi, terjadi pula efek pelebaran pada kedua pita yang mengurangi efisiensi pemisahan. Pelebaran pita tidak dapat dihilangkan secara total, namun dapat dikurangi sehingga pelebaran pita terjadi jauh lebih lambat daripada pemisahan pita. Dengan demikian pemisahan kedua komponen dapat terjadi secara sempurna pada panjang kolom yang sesuai.

Profil Konsentrasi Solut A dan B pada Jarak Migrasi yang Berbeda

Padatan pendukung pada kromatografi partisi disalut dengan fase diam cair, dan pemisahan senyawa campuran ditentukan oleh koefisien partisi masing-msing senyawa di antara kedua fase cair. Pada kedua fase yaitu fase gerak dan fase diam, salah satu diantaranya harus lebih polar dibanding yang lain. Bila fase diam lebih polar, disebut kromatografi partisi fase normal. Bila sebaliknya, disebut kromatografi partisi fase terbalik. Pada fase normal, senyawa polar lebih terbagi ke fase diam dan tertambat lebih lama dibanding senyawa nonpolar. Pada kromatografi partisi fase terbalik, terjadi hal yang sebaliknya.

Analisis Kualitatif

Proses terbawanya solut dari puncak kolom sampai akhir kolom disebut elusi. Apabila detektor ditempatkan pada ujung akhir kolom, maka akan diperoleh sinyal yang digambarkan sebagai fungsi waktu, yang disebut kromatogram. Kromatogram akan memperlihatkan bahwa setiap senyawa meninggalkan kolom sebagai puncak simetri, sehingga sinyal detektor yang tercatat berbentuk kurva Gauss pada waktu yang khas untuk setiap senyawa. Oleh karena itu, kromatogram dapat menunjukkan waktu yang diperlukan untuk elusi. Waktu yang menunjukkan puncak signal disebut waktu retensi (tR), yang tidak lain adalah waktu yang dibutuhkan analit mulai saat diinjeksikan hingga terelusi dan keluar dari kolom pada konsentrasi maksimumnya. Tiap senyawa memiliki waktu retensi yang spesifik pada kondisi tertentu, antara lain kondisi kolom, tekanan, suhu, laju aliran fase gerak, dll, sehingga dapat digunakan sebagai salah satu dasar untuk analisis kualitatif. Beberapa senyawa memiliki waktu retensi yang berdekatan, namun tiap senyawa hanya memiliki satu waktu retensi saja. Dengan membandingkan waktu retensi analit dengan waktu retensi senyawa baku maka analit dapat diidentifikasi. 

Analisis Kuantitatif

Analisis Kuantitatif Berdasarkan Tinggi Puncak

Tinggi puncak diperoleh dengan membuiat garis antara kedua dasar sisi puncak, dan mengukur tegak lurus dari garis tersebut hingga puncak kromatogram. Apabila variasi pada keadaan kolom tidak menyebabkan pelebaran puncak, dimana kromatogram yang diperoleh berupa pita yang sempit dan tajam, maka analisis kuantitatif lebih baik didasarkan pada tinggi puncak. Pengukuran ini dapat dilakukan dengan ketelitian tinggi, sehingga data yang diperoleh akan lebih akurat. Variabel yang perlu dikendalikan pada analisis ini adalah suhu dalam kolom, laju alir fase gerak, tekanan dalam kolom, dan kecepatan injeksi. Kesalahan relatif yang disebabkan oleh penginjeksian berkisar antara 5 – 10%.

Analisis Kuantitatif Berdasarkan Luas Puncak

Pengukuran dengan cara ini tidak dipengaruhi oleh pelebaran pita, oleh karena itu cara ini lebih disukai daripada pengukuran tinggi puncak. Pada umumnya, instrumen kromatografi dilengkapi dengan integrator yang memungkinkan pengukuran luas puncak secara lebih teliti. Bila tidak ada integrator maka pengukuran harus dilakukan secara manual. Konsentrasi dapat dihitung dengan persamaan:

Cx = Ax / Ap X Cp

Keterangan :

A = Peak area = Luas puncak

C = Konsentrasi

X = sampel

P = pembanding

Analisis Kuantitatif secara Kalibrasi dengan Standar

Metode untuk memperkirakan komposisi suatu campuran yang tidak diketahui adalah dengan membandingkan terhadap suatu seri larutan baku dengan berbagai konsentrasi. Setelah pembuatan kromatogram dari masing-masing larutan standar, kemudian dibuat kurva baku dengan tinggi puncak atau luas puncak sebagai fungsi konsentrasi. Sumber kesalahan utama pada metode ini terletak pada volume larutan yang diinjeksikan yang tidak reprodusibel.

Analisis Kuantitatif dengan Standar Internal

Pada metode ini dapat diperoleh ketelitian tertinggi pada analisis kuantitatif, karena variasi volume larutan yang diinjeksikan dapat dieliminasi. Pada metode ini sejumlah standar internal dimasukkan ke dalam tiap larutan standar dan larutan sampel. Analisis kuantitatif dilakukan dengan rasio luas atau tinggi puncak analit terhadap standar internal. Senyawa yang digunakan sebagai standar internal harus terpisah dari analit namun dekat dengan puncak analit.